La proteinasa similar a la subtilisina (AprBp) de Bacillus pumilus 3-19 es un candidato prometedor para uso industrial como aditivo alimentario. Sin embargo, para obtener un alto rendimiento de la enzima, es necesario desarrollar un sistema de expresión altamente eficiente.
El objetivo del estudio fue obtener una expresión estable del gen de la proteasa de B. pumilus 3-19 en el sistema de expresión de Pichia pastoris y evaluar la correlación de la actividad enzimática con la elección del tipo de vector y péptidos señal. En este estudio, para la expresión estable del gen de la proteasa optimizado en células de levadura metilotróficas, Se seleccionaron los vectores pPINK-HC y pPINK-LC. Para la secreción extracelular de proteasa recombinante, Se utilizó un conjunto de péptidos señal eficaces. La presencia del factor de apareamiento α ha conducido repetidamente a un aumento en la secreción de proteínas recombinantes. Por otra parte, las secuencias de péptidos señal asesinos y de lisozima no se han utilizado previamente para la expresión de proteasa bacteriana en P. pastoris.
Las colonias de transformantes con construcciones basadas en el vector pPINK-LC se detectaron en el tercer día de incubación y mostraron una mayor eficiencia de transformación que para las colonias con construcciones basadas en el vector pPINK-HC. que se detectaron solo en el séptimo día de incubación. La eficiencia de transformación en el décimo día de incubación para estructuras basadas en el vector pPINK-LC promedió 1.3 × 103 transformantes / μg de ADN, mientras que se registró 1,03 x 103 transformante / µg de ADN para las construcciones con el vector pPINK-HC. La PCR de colonias mostró que todas las colonias transformantes seleccionadas contenían el gen de la proteasa similar a la subtilisina integrado en el genoma de la levadura.
El estudio mostró que el tiempo de incubación afecta la síntesis de proteasa en P. pastoris, y se observó la máxima actividad de la enzima. Las cepas de levadura con construcciones basadas en el vector de baja copia pPINK-LC mostraron una mayor actividad proteasa (U / ml) en la hidrólisis de la azocaseína (2,63 ± 0,16 para el péptido señal asesino (SP), 2,49 ± 0,08 para la presecuencia del factor de apareamiento α, 2,19 ± 0,11 para lisozima SP) que las cepas con construcciones basadas en el vector pPINK-HC (1,86 ± 0,09 para killer SP, 2,21 ± 0,07 para la presecuencia del factor de apareamiento α, 1,31 ± 0,11 para lisozima SP), independientemente del péptido señal utilizado. La máxima actividad de proteasa se obtuvo para cepas de levadura con construcciones pPINK-LC-killer-aprBp (5,75 ± 0,08 U / ml) y pPINK-LC-α-mat.factor-aprBp (4,33 ± 0,07 U / ml).
Este estudio demostró que la proteasa similar a la subtilisina de cepas de P. pastoris recombinantes exhibe actividad proteolítica, que depende del tiempo de incubación y de la elección del péptido señal y del vector. La producción de proteasa bacilar mediante el sistema de expresión heterólogo basado en levadura hace que este sistema sea prometedor para el desarrollo de nuevos aditivos alimentarios para la cría de animales.
Las proteasas están clasificadas entre los tres grupos más grandes de enzimas industriales y representan aproximadamente el 60% de la venta global total de enzimas. 40% de los cuales pertenecen a proteasas bacterianas. Las serina proteasas bacterianas tienen una amplia especificidad de sustrato, y alta resistencia a diversas condiciones, que justifica su uso en biotecnología, en particular como bioaditivos para aves y animales de granja. Adicionalmente, complementar los alimentos con proteasas mejora la absorción de aminoácidos por los animales y ahorra fondos para la compra de aminoácidos sintéticos. También se ha demostrado que el uso de proteasas como aditivos alimentarios aumenta la biodisponibilidad del nitrógeno, lo que a su vez reduce los niveles de contaminación por amoniaco en el suelo. También, las proteasas facilitan la acción de otras enzimas y aumentan la rentabilidad de los piensos, así como promover el crecimiento de microflora beneficiosa en los intestinos de los pollos de engorde.
Hoy dia, En Rusia se utiliza un número limitado de proteasas comerciales de fabricantes extranjeros. Los principales representantes en el mercado ruso son los aditivos para piensos importados CIBENZA DP100 (NOVUS (88,1%), ESTADOS UNIDOS), RONOZYME® ProAct (DSM (9,4%), Suiza), Axtra® PRO TPT (DuPont (2,4%), Alemania). El recombinante obtenido comprende cepas de P. pastoris con el gen de la proteasa bacilar similar a la subtilisina (aprBp) y tres péptidos señal diferentes (factor de apareamiento α, proteína asesina y lisozima). Una mayor expresión y purificación de la proteasa del líquido de cultivo de levadura y el estudio de sus propiedades bioquímicas y enzimáticas ayudarán a evaluar las perspectivas biotecnológicas de la enzima recombinante.
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