Técnicas de cultivo de tejidos

Técnicas de cultivo de tejidos en plantas, Procedimiento de préstamo de preparación para cultivo de tejidos y desarrollo de cultivos de tejidos.

Introducción:

¿Qué es el cultivo de tejidos? El cultivo de tejidos es el cultivo de una planta durante el uso de un esqueje u otro tejido vegetal. El cultivo de tejidos es la forma más común de reproducción y clonación de plantas en invernaderos. El cultivo de tejidos se puede utilizar para reproducir plantas que demuestren una resistencia excepcional a las enfermedades, o alguna otra característica deseada. El tejido cultivado puede consistir en una sola célula, una población de células, y una parte de un órgano. Las células en cultivo pueden multiplicarse; cambiar tamaño, formulario, exhibir actividad especializada; o interactuar con otras células.

Las técnicas de cultivo de tejidos se utilizan a menudo para la fabricación comercial de plantas, así como para la investigación de plantas. El cultivo de tejidos implica la utilización de pequeños trozos de tejido vegetal, que se cultivan en un medio nutritivo en condiciones estériles. Utilizando las condiciones de cultivo adecuadas para cada tipo de explante, se puede inducir a las plantas a que creen rápidamente nuevos brotes, y, con la adición de hormonas adecuadas nuevas raíces. Estas plántulas se pueden dividir, para producir una gran cantidad de nuevas plántulas. Las nuevas plantas se pueden colocar en el suelo y cultivar de la manera normal. Medios de cultivo de tejidos , es un grupo de sistemas utilizados para cultivar células vegetales, tejidos u órganos en condiciones estériles en un medio de cultivo nutritivo de la composición conocida. El cultivo de tejidos vegetales se usa ampliamente para generar clones de una planta en un método conocido como micropropagación.

Importancia del cultivo de tejidos:

• En un tiempo y espacio relativamente cortos, se puede producir una gran cantidad de plántulas a partir del explante único.
• Tomar un explante generalmente no destruye la planta madre, plantas tan raras y en peligro de extinción se pueden clonar de forma segura.
• Es fácil seleccionar los rasgos deseables directamente desde la configuración del cultivo (in vitro), lo que reduce la cantidad de espacio necesario. para ensayos de campo.
• Una vez establecido, una línea de cultivo de tejidos puede proporcionar un suministro continuo de plantas jóvenes durante todo el año.
• El tiempo requerido se acorta mucho, no quiero esperar todo el ciclo de vida del desarrollo de la semilla. Para especies que tienen tiempos de generación prolongados, etapa baja de producción de semillas, o semillas que no germinan fácilmente, es posible una rápida propagación.
• Plantas de cultivo in vitro generalmente gratis, de las enfermedades bacterianas y fúngicas. Erradicación de virus y mantenimiento de plantas en estado libre de virus. Esto facilita el progreso de la planta a través de fronteras internacionales.
• Los bancos de cultivos de tejidos vegetales se pueden congelar y luego regenerar a través del cultivo de tejidos. Conserva las colecciones de polen y células de las que se pueden propagar las plantas.

Tipos de cultivo de tejidos:

Cultivo de semillas

El cultivo de semillas es el tipo de cultivo de tejidos que se utiliza principalmente para plantas como las orquídeas. Para este método, los explantes se obtienen de una planta derivada in vitro y se introducen en un entorno artificial, donde llegan a proliferar.

Cultivo de embriones

El cultivo de embriones es el tipo de cultivo de tejidos que implica el aislamiento de un embrión de un organismo conocido para el crecimiento in vitro. El cultivo de embriones puede ocupar el uso de un embrión maduro o inmaduro. Mientras que los embriones maduros en cultivo se obtienen principalmente de semillas maduras, implica el uso de embriones inmaduros de semillas híbridas que no germinaron. Al hacerlo, el embrión es finalmente capaz de crear una planta viable. Para el cultivo de embriones, el óvulo, la semilla de la que se va a obtener el embrión se esteriliza, y no es necesario volver a esterilizar el embrión. La sacarosa sal se puede utilizar para proporcionar nutrientes al embrión. El cultivo de embriones está enriquecido con compuestos orgánicos o inorgánicos, sales inorgánicas y reguladores del crecimiento.

Cultivo de callos

El cultivo de callos se forma por la proliferación del tejido original. Las células de un callo son parenquimatosas, amorfo y desorganizado. Generalmente, El cultivo de callos se forma como resultado de una lesión en los extremos cortados de un tallo o una raíz. Un centro de actividad localizado se registra en un callo.

Cultivo de órganos:

Eso puede permitir la diferenciación y preservación de la arquitectura. El cultivo de órganos se refiere al cultivo y mantenimiento in vitro de un órgano extirpado primordial o total o parte de un órgano en la forma y función.

Otra cultura

La androgénesis es el desarrollo in vitro de plantas haploides que se originan a partir de potentes granos de polen a través de una serie de división y diferenciación celular.

Embriogénesis somática

Este es el proceso de una sola o grupo de células que inician la vía de crecimiento que conduce a la regeneración reproducible de embriones monocigóticos capaces de germinar para formar plantas completas.

Procesamiento de células y tejidos cultivados:

Los cultivos vivos se pueden examinar directamente con un microscopio, o pueden observarse mediante fotografías e imágenes en movimiento tomadas a través del microscopio. Células, tejidos, y los órganos pueden morir, reparado, y teñido para un examen más detenido. Después de la fijación, las muestras se pueden incrustar y cortar en secciones delgadas para revelar detalles adicionales bajo un microscopio óptico o electrónico.

Las células en cultivo de tejidos vegetales se someten a una amplia gama de tratamientos experimentales. Por ejemplo, virus drogas vitaminas, Pueden añadirse al cultivo microorganismos causantes de enfermedades. Luego, los científicos observan las células, buscando cambios globales en el comportamiento celular para cambios en moléculas específicas, como alteraciones en la expresión de una proteína en particular.

Perspectivas biológicas:

El cultivo de tejidos vegetales ha permitido numerosos descubrimientos en las ciencias biológicas. Ha revelado, información básica sobre las células en cuanto a su composición y forma; su bioquímica, genético, y actividad reproductiva; y su nutrición, metabolismo, funciones especializadas. También son procesos de envejecimiento y curación; los efectos en las células de la física, químico, y agentes biológicos; y las diferencias entre células normales y células anormales, como las células cancerosas. El trabajo con cultivos de tejidos vegetales ha ayudado a reconocer infecciones, y anomalías cromosómicas, para categorizar tumores, y formular y probar medicamentos y vacunas.

Desde el descubrimiento de que ciertos virus crecen en cultivos de tejidos, la técnica se ha utilizado para producir vacunas contra la poliomielitis, sarampión, paperas, y otras enfermedades infecciosas. Los cultivos celulares han producido inhibidores virales, incluido el interferón. Las hormonas se producen a partir de cultivos de células u órganos. Se pueden usar glóbulos blancos cultivados de dos individuos para determinar la compatibilidad entre donantes potenciales y receptores de trasplantes de tejidos.

Pasos principales del cultivo de tejidos vegetales:

Fase de iniciación:

La fase de inicio es la primera parte del cultivo de tejidos vegetales. Aquí, Se obtiene y esteriliza el tejido de interés para evitar que cualquier microorganismo afecte negativamente al proceso. Es durante esta fase que el tejido se inicia en el cultivo.

Fase de multiplicación:

La fase de multiplicación es el segundo paso del cultivo de tejidos donde el material vegetal in vitro se vuelve a dividir y luego se introduce en el medio. Aquí, el medio se compone de componentes apropiados para el crecimiento, incluidos reguladores y nutrientes. Estos son los responsables de la proliferación del tejido y la creación de múltiples brotes.

Alargamiento:

Las plantas se transfieren nuevamente, en la campana de flujo laminar, en un medio que alarga los brotes. Esta es la etapa en la que los tallos de las plantas crecen en longitud y comienzan a parecerse a pequeñas plantas.

Formación de raíces:

Es en esta etapa que se forman las raíces. Aquí, se requieren hormonas para inducir el enraizamiento, y en consecuencia plántulas completas. Esto puede ocurrir en el trabajo de cultivo de tejidos en el invernadero, dependiendo de la especie. Los brotes alargados se recortan del tejido base y se colocan en medios que contienen auxinas, para enraizar. Una vez que las raíces son visibles, las plantas se pueden plantar en el invernadero. Las plantas que provienen del entorno del laboratorio han estado creciendo a humedades relativas elevadas y son muy tiernas. Deben observarse muy de cerca cuando se mueven al invernadero para asegurarse de que se estén aclimatando correctamente.

Equipo utilizado para cultivo de tejidos:

La propagación por cultivo de tejidos necesita varios equipos de laboratorio. Los diversos equipos y sus funciones son;

Autoclave: La esterilización de todos los aparatos de vidrio y medios de cultivo se puede lograr mediante el vapor generado en el autoclave.

Balanzas analíticas o de bandeja superior: Para una medición precisa de los diferentes componentes de los medios de cultivo, estos saldos serían necesarios. La balanza del plato superior se utiliza para medir cantidades mayores, mientras que la balanza analítica se utiliza para medir cantidades más pequeñas.

medidor de pH: Se utiliza para medir y ajustar la concentración de iones de hidrógeno del medio de cultivo o la solución. La concentración de iones de hidrógeno debe mantenerse con precisión para lograr un crecimiento óptimo de las plantas.

Armarios de flujo de aire laminar: En estos gabinetes, los brotes desarrollados en explantes se separan de los racimos y se transfieren a un medio fresco en condiciones estériles.

Conjuntos de destilación: El agua que se utilizará para la preparación de los medios de cultivo debe estar libre de impurezas y sales.

Aires acondicionados con estabilizadores: Mantenimiento de la temperatura preferida en la sala de crecimiento, La sala de inoculación o la sala de transferencia de cultivos sería posible con aire acondicionado en estas áreas.

Microscopios: a) Microscopio estereoscópico:esto permitiría disecar meristemas de tamaño pequeño de las puntas de los brotes quitando las cubiertas protectoras de los primordios de las hojas.

1. b) Microscopio compuesto:permite la detección de bacterias y hongos en cultivos y tejidos vegetales.

Unidad de lavado de botellas: Dado que una gran cantidad de botellas o recipientes en los que se desarrollarán las plantas deben lavarse repetidamente antes de su uso, una unidad automática de lavado de botellas sería útil.

Bandejas: Estructura de soporte para frascos o recipientes de cultivo.

Escotillas: Pase a través de cajas que se utilizan como puerta de entrada entre el área limpia y el área semilimpia para el intercambio de materiales.

Kits de disección: Estos son necesarios para la separación de brotes y preparación de micro esquejes.

Usos del cultivo de tejidos vegetales:

El cultivo de tejidos vegetales se utiliza para aumentar miles de plantas genéticamente idénticas de una sola planta parental llamada clones de soma. Dado que este proceso de micropropagación produce nuevas plántulas por miles, Se ha utilizado ampliamente para la fabricación de plantas comercialmente importantes, incluidas las plantas alimenticias como tomate , Plátano , y manzana , etc. Un ejemplo de la aplicación de la micropropagación se observó en el cultivo de orquídeas, ya que aumentó exponencialmente debido a la accesibilidad de millones de plántulas gracias a los métodos de cultivo de tejidos. ¿Por qué es importante el cultivo de tejidos vegetales? En esta cultura, el medio de crecimiento o la solución de cultivo es muy importante ya que se utiliza para el crecimiento de tejido vegetal porque contiene varios nutrientes vegetales en forma de "gelatina" conocida como agar y hormonas vegetales que son necesarias para el crecimiento de las plantas.

Requisitos del cultivo de tejidos vegetales:

Alcance y formación del cultivo de tejidos vegetales, se refiere al cultivo in vitro de plantas, semillas y varias partes de las plantas (órganos, embriones, tejidos, celdas individuales, y protoplastos).

El cultivo de tejidos vegetales es una de las áreas de la biotecnología de más rápido crecimiento debido a su alto potencial para desarrollar cultivos mejorados y plantas ornamentales. Con los avances realizados en el cultivo de tejidos, tecnología, ahora es probable que se regeneren especies de cualquier planta en el laboratorio. Para conseguir el objetivo de crear una nueva planta o una planta con las características deseadas, El cultivo de tejidos a menudo se combina con tecnología de ADN recombinante. Las técnicas de cultivo de tejidos vegetales han contribuido en gran medida a la revolución verde al mejorar el rendimiento y la calidad de los cultivos. La información obtenida de cultivos de tejidos vegetales ha contribuido a nuestra comprensión del metabolismo, crecimiento, diferenciación y morfogénesis de células vegetales. Debido a la amplia gama de aplicaciones, El cultivo de tejidos vegetales atrae la atención de los biólogos moleculares. fitomejoradores e industriales. ¿Quién introdujo el cultivo de tejidos vegetales? En el siglo 19, nació la idea de experimentar con tejidos y órganos de plantas en condiciones controladas de laboratorio. Por primera vez en 1902, un fisiólogo alemán, Gottlieb Haberlandt, desarrolló la teoría del cultivo celular in vitro.

De acuerdo con la tecnología y el objetivo de la propagación de cultivos de tejidos, también se pueden requerir varias instalaciones a continuación;

Tierra: Se requiere la creación de un laboratorio, unidad de planta madre, invernadero y oficina. Es posible que se requiera espacio para instalar un pozo tubular o un pozo excavado y para estacionar vehículos.

Plantas Madre: Las Plantas Madre proporcionarían una fuente de tejidos. Su rendimiento debe probarse antes de su uso. como fuente de explantes. En caso de vinculación con laboratorios bien establecidos, los explantes de las pruebas de plantas madre pueden estar disponibles sin costo alguno. De lo contrario, colección, sería necesario el mantenimiento y la prueba de plantas madre superiores.

Laboratorio: Un laboratorio de cultivo de tejidos normalmente consta de una sala de preparación de medios, sala de almacenamiento de medios, sala de inoculación, sala de transferencia de cultura, Área de lavado, etc. El plano de la planta debe diseñarse para promover la máxima eficiencia. El diseño debe facilitar el mantenimiento de la temperatura óptima, humedad, iluminación y ventilación. El diseño correcto de un laboratorio no solo reducirá la contaminación, sino que también logrará una alta eficiencia en el desempeño del trabajo. Los laboratorios debidamente planificados y diseñados pueden reducir los costos operativos y energéticos.

Invernadero en cultivo de tejidos: En la propagación de cultivos de tejidos, Puede ser necesario un invernadero para cultivar y mantener plantas madre de modo que el crecimiento de órganos adecuados para el cultivo de tejidos sea máximo, especialmente en el caso de plantas ornamentales, y para endurecer las plántulas con regularidad en un entorno natural. El invernadero permitirá controlar la intensidad de la luz y la humedad, que es esencial para el endurecimiento de las plantas.

Electricidad: Como se desprende de los párrafos anteriores, ningún laboratorio de cultivo de tejidos puede funcionar sin electricidad. La electricidad es esencial para proporcionar la intensidad de luz requerida a los tejidos y brotes en crecimiento mientras están en el laboratorio. para operar varios equipos e instalaciones, que incluyen aires acondicionados.

Agua: Agua para el cultivo de plantas madre, endurecimiento de las plántulas, cantina, baños, Se requiere agua destilada para la preparación de medios de cultivo y reactivos.

Materias primas: Materias primas necesarias para el proyecto de cultivo de tejidos, aparte del explante, son componentes diferentes de los medios de cultivo.

Mano de obra calificada: El cultivo de tejidos vegetales es una operación altamente especializada. Sería, por lo tanto, Será necesario que los trabajadores de laboratorio e invernaderos estén bien calificados y tengan experiencia en la tecnología. Sería útil su formación en laboratorios comerciales bien establecidos.

Etapas del cultivo de tejidos vegetales:

¿Qué plantas se cultivan mediante cultivo de tejidos? Las nuevas plantas se pueden colocar en el suelo y cultivar de la manera normal. Muchos tipos de plantas son apropiados para su uso en el aula. Coliflor , esquejes de rosas, Las hojas de violeta africana y los tallos de clavel producirán clones fácilmente a través del cultivo de tejidos.

Preparación de medio nutritivo

Se prepara un medio semisólido en agua bidestilada que contiene macroelementos, microelementos, aminoácidos, vitaminas, fuente de hierro, fuente de carbono como sacarosa y fitohormonas. El medio se calienta para disolver el agar y se dispensan de 25 ml a 50 ml en cada frasco de boca ancha. Los recipientes que contienen los medios de cultivo se sellan y esterilizan en autoclave.

Establecimiento de cultivo aséptico

El material de partida para el procedimiento es generalmente una punta de brote en crecimiento activo de yema auxiliar o terminal o punta de brote de una planta. El procedimiento de cultivo de tejidos vegetales parte de la selección de plantas madre que tengan las características deseadas.

Explante si es posible, se aísla el tejido meristemático de la planta madre seleccionada. El tejido / explante extirpado se lava con agua y luego se enjuaga con un desinfectante como la solución de savlon o Dettol seguido de un lavado con agua estéril. Luego, el tejido se sumerge en una solución de lejía al 10% durante diez minutos para desinfectar el material de tejido vegetal. matando a la mayoría de los organismos fúngicos y bacterianos. El procedimiento de esterilización de explantes depende de las especies de plantas y tipos de explantes.

Inoculación

El proceso de inoculación se realiza en condiciones asépticas. En este procedimiento, los explantes o micro brotes se transfieren al medio nutritivo esterilizado.

Desarrollo de plantas en la sala de crecimiento.

Después de la inoculación del tejido vegetal, las botellas se sellan y se transfieren a la sala de cultivo para desencadenar un proceso de desarrollo bajo luz difusa a 23 a 27 ° C y 50 a 60% de humedad relativa. Los requisitos de luz y temperatura varían de una especie a otra y, a veces, durante las diversas etapas de desarrollo.

Los cultivos se observan diariamente en busca de crecimiento y cualquier signo de infección o contaminación. Culturas, que no muestren un crecimiento excelente o estén infectados, se descartan. Los cultivos sanos se convierten en pequeños brotes. Estos se subcultivan en medio fresco después de cuatro semanas. El número de subcultivos necesarios es específico de la especie vegetal, que están estandarizados. Los brotes generalmente se desarrollan después de cuatro semanas. Después de que se desarrolle una cantidad suficiente de brotes en cada recipiente, a una altura mínima de 2 cm se trasladan a otro medio para iniciar el procedimiento de enraizamiento. El componente del estándar de enraizamiento para cada especie vegetal es específico. Las raíces generalmente se forman dentro de dos a cuatro semanas. Las plantas en esta etapa son delicadas y requieren un manejo cuidadoso.

Endurecimiento de microplantas

Debido a la muy alta humedad dentro del recipiente de cultivo y las condiciones artificiales de desarrollo, las plántulas están tiernas y, por lo tanto, no están listas para hacer frente a las condiciones del campo. Las plantas extraídas del medio estéril se lavan y se mantienen bajo neblina intermitente o se cubren con plástico transparente limpio. Después de 10 a 15 días bajo alta humedad, las plantas se transfieren al invernadero y se mantienen durante otras 4 a 6 semanas. Luego se completan para ser transferidos a una nueva casa o al campo. Normalmente, las plantas de cultivo de tejidos vegetales se venden como plantas ex-agar o como plantas endurecidas del invernadero.

El procedimiento de cultivo de tejidos vegetales:

Las partes de la planta que se utilizan para el cultivo se denominan explantes. Los explantes se cultivan in vitro en un medio nutritivo que satisface sus necesidades nutricionales. El medio nutritivo debe proporcionar lo siguiente:

1. Macronutrientes:esto incluye elementos como nitrógeno (N), fósforo (P), potasio (K), calcio (Ca), azufre (S) que es necesario para un crecimiento y morfogénesis adecuados.
2. Micronutrientes:elementos como el hierro (Fe), manganeso (Mn), zinc (Zn), etc., que es crucial para el crecimiento de los tejidos.
3. Fuente de carbono o energía:este es uno de los principales ingredientes cruciales de los medios de nutrientes. La sacarosa es la fuente de carbono más utilizada entre otros carbohidratos.
4. Vitaminas aminoácidos, y otras sales inorgánicas.

Los medios de cultivo también sirven como medio para suministrar reguladores del crecimiento de las plantas a los problemas que provocan su morfogénesis según las necesidades. Los tejidos de los explantes primero pierden su especificidad para formar un bulto marrón duro llamado callo. El callo luego se divide para aumentar un órgano de la planta o una planta completamente nueva dependiendo de la cantidad y composición de fitohormonas suministradas. Todo el procedimiento requiere que se mantengan estrictas condiciones asépticas en todo momento, ya que una sola contaminación puede arruinar todo un lote de plantas. ¿Por qué el cultivo de tejidos se denomina micropropagación in vitro? El cultivo de tejidos es un método de propagación utilizado para generar plantas en condiciones estériles. Se llama micropropagación in vitro, porque, los explantes se cultivan en medio y los recursos genéticos se conservan en forma de. Las plantas micropropagadas están libres de virus y muestran una mayor productividad y rendimiento.

Ventajas del cultivo de tejidos vegetales:

Multiplicación masiva de clones de élite: La micropropagación permite la creación de un gran número de plantas a partir de pequeños trozos de la planta madre. La producción requiere períodos de tiempo moderadamente cortos para cultivar plantas. Dependiendo de la especie en producción, una ex-planta se puede multiplicar en varios miles de plantas en menos de un año.

Plant improvement through tissue culture: Creation of superior varieties of agricultural crops is possible through plant tissue culture method, which otherwise is not possible during conventional plant breeding methods.

True to Type production: a Large number of true to the type plants can be propagated within a short time and space and that too throughout the year. Por ejemplo, it may be possible to propagate 2 to 4 lakhs of tissue cultured plants from a single bush or rose against 10 to 15 plants by conventional means. También, it may take about 2 to 4 months to produce a healthy planting material by tissue culture means, whereas a minimum of 6 to 8 months is required for most species by the latest method of plant propagation.

Higher yields: Tissue Culture Plants may have increased branching &flowering, greater vigor and higher yield, mostly due to the possibility of elimination of diseases.

Beneficial when conventional propagation is difficult: The process may succeed to propagate plants where seeds or conventional propagation is not possible or undesirable.

Flexible method: The flexibility of nurseries can be better. As the capital investment on the mother plant is reduced to almost zero, it can be easier to adapt to changing conditions.

The innovation of new varieties: Plant tissue culture can be utilized for breeding new varieties.

Financial assistance in Tissue culture:

The tissue-culture export-oriented developments are eligible for refinance support by NABARD. Banks can provide loans for the activity provided the scheme is technically feasible &financially viable.

Bank Loan:

A bank loan of 75 to 80 % of the total cost of development shall be available from the financing institution. Bank loan considered in the model is 75%.

La tasa de interés:

Banks are free to choose the rate of interest within the overall RBI guidelines issued from time to time. Sin embargo, the final lending rate has been considered as 12% for working out the bankability of the model project.