Técnicas de plantas de cultivo de tejidos para principiantes
Técnicas de plantas de cultivo de tejidos:
Introducción a las plantas de cultivo de tejidos:
La técnica de mantenimiento y crecimiento de células vegetales. tejidos, y otras partes de la planta en condiciones estériles en un medio nutritivo se llama 'cultivo de tejidos' en plantas. Esta técnica o cultivo de tejidos se utiliza con fines de propagación. Por lo tanto, este método también se conoce como micropropagación. Mediante el uso de este método, un clon de una planta se produce en un ambiente controlado y luego se propaga al ambiente externo. La parte de la planta que se utiliza para el cultivo de tejidos se denomina "Explante" . Este cultivo fue establecido por primera vez por Gottlieb Haberlandt en el año 1902. La capacidad de una célula vegetal para regenerarse en una planta completa se denomina biológicamente como "Totipotencia celular". Los explantes se cultivan en contenedores con un medio rico en nutrientes. Todos los materiales relacionados con el cultivo de tejidos se esterilizan antes de su uso para prevenir infecciones y pudrición del tejido. Existen diferentes tipos de cultivo de tejidos en plantas como Callus Culture, Cultura de órganos, Cultivo unicelular, Cultura de suspensión, Cultivo de embriones, Otra cultura, Cultura de polen, Embriogénesis somática, Cultivo de protoplastos, Shoot tip y Meristem Culture y Explant Culture. Los tres aspectos principales del entorno necesarios para el cultivo de tejidos son el medio nutritivo (la mezcla de sales, vitaminas, nutrientes, y otros estimuladores del crecimiento), las condiciones asépticas (esterilización), y la aireación del tejido (incluye la agitación del medio). Se espera que el cultivo de tejidos en plantas se someta a cuatro etapas antes de propagarse al ambiente externo. Las etapas son:
Etapa 1 o fase de inicio:Se esteriliza el explante a cultivar para evitar el desarrollo de microorganismos que puedan afectar negativamente al proceso.
Etapa 2 o la fase de multiplicación:En esta etapa, el explante se vuelve a dividir y se introduce en el medio. Aquí el tejido prolifera y produce nuevos brotes.
Etapa 3 o formación de la raíz:se utilizan hormonas para inducir el enraizamiento y los explantes se preparan para transferirlos a los medios de cultivo habituales.
Etapa 4 o fase de establecimiento:Los propágulos finalmente se trasladan a las condiciones externas del suelo.
Ventajas de las plantas de cultivo de tejidos:
Se puede cultivar una gran cantidad de plántulas en menos tiempo y espacio con un solo explante.
Los tejidos de las plantas están influenciados por otros controles correlativos de las plantas que pueden aislarse con esta técnica.
Se crea la misma réplica de plantas para producir buenas plantas frutales y con flores.
Este método es extremadamente rápido para producir plantas maduras.
Cuando no se dispone de semillas o polinizadores, entonces esta técnica es útil.
Se puede desarrollar una nueva especie de planta modificada genéticamente.
Las condiciones estériles tienen menos riesgo de enfermedades, plagas y otros patógenos.
Las semillas que tienen menos posibilidad de germinación como las orquídeas y Nepenthes se pueden cultivar a través de este método.
Los propágulos se pueden almacenar durante mucho tiempo en un área pequeña.
Desventajas de las plantas de cultivo de tejidos:
Esta técnica puede incluir un 70% más de mano de obra y es cara.
Las plantas desarrolladas bajo un ambiente acondicionado tienden a perder resistencia a las enfermedades. Por tanto, existe el riesgo de que las plantas sean vulnerables a las mismas infecciones.
Una muestra de tejido vegetal profundamente infectado puede producir una planta infectada si no se analiza adecuadamente en busca de virus e infección antes de realizar el cultivo.
No es cierto que todas las plantas se cultiven con éxito; a veces, las sustancias químicas metabólicas secundarias de las plantas pueden matar el explante o detener su crecimiento.
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Plantas cultivadas con la técnica de plantas de cultivo de tejidos:
Las plantas que se han cultivado con éxito utilizando la técnica de cultivo de tejidos son Banana, Piña, Higo, Parval, Tindora, Limón, Jengibre, Batata, Caña de azúcar, Tomate, Patata, Repollo, Papaya, Mango, Guayaba, Fresa, Cúrcuma, Jatropha, Eucalipto, Teca, Orquídeas Bambú, etc.
Materiales necesarios para las plantas de cultivo de tejidos:
Si el cultivo de tejidos se practica en casa, luego hay algunos materiales disponibles que pueden ser útiles.
Tarros largos de comida para bebés.
Tapas de fito para tapar los frascos.
Pinzas.
Media (Murashige y Skoog con vitaminas).
medidor de pH.
Juego de cucharas medidoras.
Pipeta.
Olla a presión para esterilizar el equipo.
Capota, como un recipiente de plástico con orificios al revés.
Una botella de spray.
Mezcla de conservantes vegetales (PPM).
Preparación de los medios para plantas de cultivo de tejidos:
Instalación de cultivo de tejidos vegetales.
El medio para plantas de cultivo de tejidos está compuesto de macronutrientes, micronutrientes, vitaminas, reguladores de crecimiento, y carbohidratos o sacarosa. Estos elementos son comunes para la mayoría de las plantas y están diseñados por Murashige y Skoog. Algunos grupos especiales de plantas como las coníferas pueden requerir nutrientes adicionales. Los componentes generales de los medios de comunicación son:
Minerales para apoyar la vida de las plantas.
El magnesio es parte de las moléculas de clorofila.
El calcio es el componente de la pared celular.
El nitrógeno es parte de los aminoácidos, proteínas, vitaminas, un ácido nucleico.
Ferroso, zinc, y el molibdeno son parte de las enzimas.
Aparte de estos elementos, hay algunos elementos adicionales que las plantas requieren para el crecimiento, como el carbono, hidrógeno, oxígeno, fosforoso, azufre, potasio, manganeso, cobre, sodio, silicio, níquel, cobalto, vanadio, selenio, y boro.
Hay algunos nutrientes orgánicos producidos por las propias plantas, pero para cultivo de tejidos, estos suplementos deben proporcionarse como tiamina (vitamina B1), Niacina (vitamina B3), Piridoxina (vitamina B6), y Mioinositol (complejo de vitamina B).
A parte de estos, el cultivo de tejidos en plantas requiere reguladores del crecimiento como la auxina (para la división celular y la síntesis de la pared celular), Citoquinina (estimula la multiplicación de brotes), Giberelinas (desarrollo de plántulas).
Preparación de los medios para plantas de cultivo de tejidos:
Es una tarea muy difícil pesar cada constituyente para preparar el medio para cada tejido vegetal. Entonces, convenientemente, la reserva del medio se prepara y se almacena en el refrigerador y se verifica periódicamente para detectar contaminación o precipitación. Los medios habituales utilizados para el cultivo de tejidos están fácilmente disponibles en el mercado con una especificación para cada uno.
Medio de White (el medio más antiguo para el cultivo de tejidos).
Medio MS (medio de uso común preparado por Murashige y Skoog).
Medio B5 (utilizado para suspensión celular, cultivo de callos, y ahora para el cultivo de protoplastos desarrollado por Gamborg).
Medio N6 (utilizado para cultivo de anteras de cereales).
Medio de Nitsch (utilizado para otra cultura).
Aquí se describe un ejemplo del proceso de mezcla de medios:
El recipiente de 1 litro se llena con tres tazas de agua.
Se añaden 2,2 go medio paquete de medio MS con 2 cucharadas de azúcar y se mezcla bien.
A esta solución se le añaden 1 ml de BAP (bencil adenina) y 1 ml de PPM (mezcla conservante de plantas).
Se agrega agua para hacer 1 litro de la mezcla. El pH de la solución debe estar entre 5 y 6 o entre 5,6 y 5,8. Si el PH es ácido, agregue una pequeña cantidad de bicarbonato de sodio y mezcle bien. De lo contrario, si el PH es básico, agregue unas gotas de vinagre y mezcle bien.
Dispense el medio en el frasco para bebés una vez que se alcance el pH requerido. Cada frasco puede contener 25 ml de la solución.
Se añaden 30 ml o 50 ml del agente gelificante agar a la solución de 25 ml.
Los frascos se tapan y se colocan en condiciones de calor, como en un microondas, olla a presión, etc. para esterilización.
Medios de esterilización y explantes para plantas de cultivo de tejidos:
El medio utilizado para el cultivo de plantas se lleva a un recipiente de vidrio y se sella con tapones de algodón o plástico y se esteriliza mediante el método de autoclave durante 30 minutos a 15 libras por unidad cuadrada de presión. Las vitaminas, aminoácidos, hormonas y otros extractos de plantas se destruyen durante el autoclave, por lo tanto, la solución de estos compuestos se esteriliza mediante el uso de papel de filtro Millipore con un diámetro de poro de 0,2 micrómetros. Cuando se seleccionan árboles o plantas viejos para el cultivo de tejidos, la esterilización del explante es un problema grave debido a la contaminación. Las esporas de las plantas se eliminan mediante el uso de insecticidas y pesticidas y cubriendo los brotes con bolsas de película transparente antes de recoger el explante. La superficie tiene contaminación microbiana, por lo que se esteriliza completamente antes de plantar en el medio nutritivo. Hipoclorito etilo, y el alcohol isopropílico se utilizan como soluciones esterilizantes de superficie para tejidos vegetales. Los explantes se lavan primero en agua destilada o agua tibia durante 20 a 20 minutos para eliminar las partículas de polvo. luego con una solución de detergente, y finalmente con soluciones al 0,1% de HgCl2 y NaCl durante cinco minutos. Los explantes se lavan de nuevo con agua destilada esterilizada para eliminar los segmentos nodales estériles de los explantes. Es imprescindible el uso de fórceps estériles para manipular el tejido o el explante.
Agentes gelificantes para plantas de cultivo de tejidos:
Para el cultivo de tejidos en plantas si se utiliza un medio líquido, entonces existe el riesgo de que el tejido se sumerja y la falta de suministro de oxígeno pueda resultar en la muerte del tejido. Para superar este problema se utiliza un agente gelificante. Los agentes gelificantes deben tener una propiedad que es muy esencial para el cultivo de tejidos y es que el agente debe formar un líquido cuando se calienta. se vuelven semisólidos cuando se enfrían y resisten la esterilización. Los agentes gelificantes más utilizados son Agar, Agarosa y Gelrite. Otros agentes gelificantes disponibles son las gomas Gellan, Ácido algínico, y Gelcarin. El gel se usa principalmente para reafirmar los medios; por lo tanto, se agrega en forma de polvo y se calienta de manera que alcance la temperatura de ebullición. A medida que los medios se enfrían, forma el gel. Este gel es una superficie sólida parcial para anclar el explante de ser sumergido, pero lo suficientemente suave para ayudar a los explantes a absorber los nutrientes. Las mezclas de medios están fácilmente disponibles en el mercado con el agente gelificante y las hormonas añadidas. Por ejemplo, para los medios de comunicación de MS, 1 litro de la solución necesita 4,33 g de la mezcla prefabricada, pero si también está presente un agente gelificante como el agar, entonces 1 litro de la solución necesita 9-12 g de la mezcla.
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Multiplicar y hacer crecer las plantas de cultivo de tejidos:
Como el explante se establece en el medio, debe cultivarse en condiciones de luz buenas y moderadas. El fotoperiodo debe ser largo. La temperatura debe ser estable alrededor de los 25 grados Celsius pero puede variar entre 22 y 28 grados Celsius. Cuando el tejido o el explante dejan de crecer, es hora de reemplazarlos o dividirlos para formar subcultivos. Para hacer esto, se preparan el espacio de trabajo y los medios estériles necesarios. Para reemplazar el pañuelo, es necesario simplemente sacarlo del frasco y colocarlo en el nuevo frasco con el medio. Pero si hay que dividir el tejido, entonces el área de trabajo estéril está configurada para cortar el tejido en pedazos y colocarlos en frascos. Los instrumentos utilizados para cortar deben esterilizarse antes de su uso.
Condiciones previas al trasplante para plantas de cultivo de tejidos:
Esta es la etapa del cultivo de tejidos en la que los brotes o las plántulas que crecieron se estimulan para el crecimiento y el endurecimiento de las raíces. También se realiza dentro del entorno interno, como un tubo de ensayo. Después del proceso de micropropagación, El crecimiento de las raíces es un requisito esencial y no ocurre en las primeras etapas. Las plántulas se colocan en un medio que estimula el crecimiento y la iniciación de las raíces, como la auxina.
El endurecimiento prepara la planta para su cultivo en el entorno natural. Dado que las plántulas se cultivan en una zona acondicionada, requieren tiempo para adaptarse al entorno externo. Las plantas se vuelven susceptibles a enfermedades cuando se extraen del in vitro. El endurecimiento de las plántulas implica destetarlas lentamente de la constante, alta humedad estable, luz baja, y niveles de ambiente cálido a luz variable e inestable, humedad, y niveles de temperatura. El ambiente externo también se mantiene en niveles altos de humedad mediante riego por nebulización o colocando cubiertas de plástico con un agujero sobre las plantas.
Ex Vitro para plantas de cultivo de tejidos:
Para transferir las plantas al entorno natural externo, Es muy importante que se eliminen los medios de cultivo de tejidos de las raíces. Para hacer esto, las plántulas se ponen bajo un chorro de agua tibia de manera que la fuerza del agua limpie completamente el medio de las raíces. Si esto no se hace, entonces existe el riesgo de que los mohos (hongos) se alimenten del sustrato y destruyan las plantas. El tratamiento de las plantas debe ser el mismo que se trató in vitro. La cubierta de bolsas de plástico sobre las plantas debe permanecer durante una semana hasta que las plantas se adapten al entorno natural. Las plantas deben mantenerse alejadas de la luz solar directa y una vez que se endurezcan, pueden tratarse como cualquier otra planta cultivada en el suelo.
Futuro de las plantas de cultivo de tejidos:
La industria agrícola puede volverse sostenible con bajos insumos energéticos y rendimientos de alta calidad con la ayuda de la biotecnología. La técnica de cultivo de tejidos en plantas puede producir plantas de calidad superior, pero su potencial no se ha explotado en muchos países en desarrollo. El índice de rendimiento de las plantas cultivadas con tejidos es alto en comparación con las plantas propagadas convencionalmente. El mercado de una variedad mejorada de plantas puede ser lento si la tasa de multiplicación es lenta. El cultivo de tejidos puede ayudar a acelerar este proceso mediante una propagación más rápida. El uso de productos químicos también se reduce porque las plantas se cultivan en un entorno resistente a las enfermedades. Debe reconocerse y aplicarse la importancia del cultivo de tejidos en plantas para una mayor producción agrícola y también para generar empleo rural en los países en desarrollo.
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