de Constantinos C Mylonas, Coordinador de proyectos (HCMR, Greee), Birgitta Norberg, Reproducción y genética - Líder del fletán atlántico (IMR, Noruega), Kristin Hamre, Nutrición - Líder del fletán atlántico (NIFES / IMR, Noruega), Torstein Harboe, Cría de larvas - Líder del fletán atlántico (IMR, Noruega), Sonal Patel, Salud de los peces - Líder del fletán atlántico (IMR, Noruega; actualmente en VAXXINOVA, Noruega) y Rocío Robles, Líder de Difusión (CTAQUA, España)
Una de las especies incluidas en el proyecto DIVERSIFY, financiado con fondos comunitarios, que corrió entre 2013 y 2018 fue el fletán atlántico (Hippoglossus hippoglossus). El fletán atlántico es el pez plano más grande del mundo y puede alcanzar un peso de más de 300 kg. Es muy apreciado en los mercados de todo el mundo, pero la disponibilidad de fletán negro salvaje está disminuyendo.
Las poblaciones noruegas se clasifican como viables, pero la pesca está sujeta a una reglamentación estricta. Esto ha llevado a una mayor demanda del mercado de fletán negro, que no pueden ser satisfechas únicamente por la pesca.
El fletán del Atlántico (ver figura 1) es un pescado semigraso, rico en ácidos grasos omega-3, con una característica carne blanca hojaldrada con pocos huesos. El fletán negro cultivado tiene una excelente reputación y tradicionalmente se comercializa como filetes o chuletas de pescado grandes. Puede ser ahumado o marinado al típico estilo escandinavo. Estas características llevaron a la inclusión del fletán atlántico en DIVERSIFY, como un gran candidato para la diversificación de especies y productos pesqueros en la acuicultura europea.
Los esfuerzos de investigación y cultivo del fletán atlántico comenzaron en la década de 1980, y aunque la producción anual total de fletán atlántico cultivado está aumentando, todavía solo alcanzó ~ 1600 toneladas en 2017 (Dirección de Pesca de Noruega).
En Europa, Existen granjas de fletán del Atlántico en Noruega y Escocia. El tamaño de mercado deseado es de 5 a 10 kg y el tiempo de producción actualmente es de cuatro a cinco años. A pesar de un importante esfuerzo de investigación entre 1985 y 2000, el complicado ciclo de vida del fletán negro hizo que el progreso de la acuicultura fuera lento, y posteriormente se asignaron muy pocos fondos para la investigación.
Sin embargo, Durante este tiempo, los agricultores han realizado progresos lentos pero constantes para mejorar la estabilidad de la producción. y el interés en la cultura tanto en jaulas como en tierra está creciendo. Los cuellos de botella restantes para una producción mayor y estable están relacionados con un suministro constante de alevines y la necesidad de disminuir el tiempo de producción.
Esto último puede lograrse con el reciente establecimiento de la producción juvenil "exclusivamente femenina". Se espera que esto tenga un impacto importante en el tiempo de producción, ya que las hembras crecen más rápido y maduran más tarde:el 80 por ciento de los peces sacrificados de menos de 5 kg son machos maduros.
El proyecto DIVERSIFY abordó estos importantes cuellos de botella con un esfuerzo de investigación coordinado en reproducción, nutrición y cría de larvas y desarrollo de vacunas. La combinación de biológicos, Se espera que las actividades de investigación tecnológica y socioeconómica desarrolladas en DIVERSIFY apoyen la diversificación de la industria acuícola de la UE y ayuden a expandir la producción. aumento de los productos de la acuicultura y desarrollo de nuevos mercados.
Reproducción
La investigación en nuestro proyecto confirmó que las hembras capturadas en la naturaleza desovan de manera confiable y producen huevos de muy alta calidad de manera constante (> 85% de fertilización). Las hembras cultivadas también produjeron huevos de alta calidad cuando se identificaron sus ciclos ovulatorios. y la extracción se llevó a cabo cerca de la ovulación (ver figura 2).
Para la producción comercial, así como con fines de reproducción, no es práctico depender de hembras capturadas en la naturaleza. Sin embargo, relativamente pocas hembras cultivadas produjeron huevos de manera consistente con tasas de fertilización> 80-85 por ciento. Como consecuencia, puede ser necesario incluir reproductores capturados en la naturaleza también en futuros grupos de reproducción para asegurar un material genético suficientemente amplio.
Las concentraciones plasmáticas de esteroides sexuales en criadores de granjas fueron similares a lo que se informó anteriormente en el fletán negro del Atlántico, con perfiles anuales siguiendo el crecimiento y la maduración de los ovarios. Los niveles más altos de 17β-estradiol (E2) se registraron justo antes del desove, a principios de febrero, mientras que tanto la E2 como la testosterona (T) se mantuvieron elevadas durante el período de desove.
No se observaron diferencias en las concentraciones promedio entre las hembras capturadas en el medio silvestre y las criadas. Las concentraciones plasmáticas de la hormona estimulante del folículo gonadotropinas (FSH) y la hormona luteinizante (LH) se documentaron por primera vez en el fletán negro.
Las concentraciones medias de FSH fueron relativamente estables durante la vitelogénesis, desde octubre hasta principios de febrero, consistente con una liberación constitutiva de FSH de la pituitaria. La FSH plasmática disminuyó a niveles bajos durante el desove, pero aumentó nuevamente después de que se completó el desove.
Las concentraciones plasmáticas de LH mostraron grandes variaciones individuales a lo largo del ciclo reproductivo, pero se detectaron niveles altos durante el desove. Esto fue consistente con los resultados previamente reportados en otros teleósteos, incluyendo varios peces planos.
La implantación con un agonista de la hormona liberadora de gonadotropina (GnRHa) no avanzó significativamente el tiempo de desove en las hembras de fletán del Atlántico, pero se observó una aparente sincronización en el tiempo de desove entre los individuos, ya que las hembras tratadas habían completado el desove un mes antes de que se agotaran los peces de control. En producción comercial, La sincronización entre individuos puede ser una ventaja, ya que los esfuerzos del personal en la recolección de huevos pueden concentrarse en un período relativamente corto (ver figura 3).
Los criadores de fletán del Atlántico deben ser monitoreados para la ovulación y despojados de forma regular. y los huevos se fertilizan in vitro. Por lo tanto, el uso de la implantación de GnRHa ofrece una ventaja logística para el manejo comercial de reproductores de la especie, reduciendo la temporada de desove.
Nutrición
Para el desarrollo de un protocolo para el destete temprano de las larvas de fletán negro, encontramos una gran diferencia con respecto a la ingesta de alimento de las larvas en tres dietas comerciales diferentes a los 28 días después de la primera alimentación (dpff) (ver figura 4).
Las larvas alimentadas con la dieta comercial de larvas marinas Otohime (Japón) tenían las tripas llenas después de cinco días de alimentación. Esta dieta se utilizó en un experimento destinado a encontrar el momento más temprano de destete a los 15, 22 y 28 dpff. El destete a los 15 dpff resultó en casi el 100 por ciento de mortalidad, a 22 dpff aproximadamente un 30 por ciento de mortalidad y a 28 dpff, casi cero por ciento de mortalidad.
La conclusión fue que las características de la dieta son importantes para asegurar la ingesta de alimento en las larvas de fletán del Atlántico y que las larvas están listas para alimentarse con un alimento formulado solo a 28 dpff. Se necesitan más experimentos para evaluar si las primeras larvas crecen y se desarrollan bien con estas dietas.
También, Se desarrolló un protocolo para la producción de Artemia en crecimiento y se analizó la composición de nutrientes. Artemia cultivada durante tres días en el medio de cultivo ORI-culture (Skretting, España) y luego enriquecido con el medio LARVIVA Multigain (Biomar, Dinamarca) obtuvo un perfil de nutrientes mejorado en muchos aspectos.
La proteína aumento del contenido de aminoácidos libres y taurina, disminución de lípidos y glucógeno, mientras que la proporción de fosfolípidos (PL) a lípidos totales (TL) aumentó. La composición de ácidos grasos mejoró en un experimento, pero no en el realizado en el socio comercial. Los perfiles de micronutrientes no se vieron afectados negativamente por el cultivo de Artemia en el medio de cultivo ORI.
Dado que investigaciones anteriores habían encontrado que las larvas alimentadas con Artemia adulta se convirtieron en juveniles de mejor calidad, las larvas se alimentaron con Artemia en crecimiento en comparación con los nauplios de Artemia convencionales en DIVERSIFY (ver figura 5).
No hubo diferencias en el crecimiento, la pigmentación o migración ocular entre los dos grupos y la composición de nutrientes de las larvas después de tres semanas de alimentación fue muy similar. La conclusión fue que los nauplios de Artemia producidos con métodos modernos tienen niveles de nutrientes suficientes para cubrir las necesidades de las larvas de fletán del Atlántico.
También, la hipótesis de que las larvas criadas en sistemas de recirculación de acuicultura (RAS) tendrían otra microflora en el intestino y, por lo tanto, tienen diferente absorción de nutrientes. Sin embargo, excepto por niveles más altos del derivado de vitamina K MK6, no encontramos diferencias en la utilización de nutrientes entre las larvas criadas en RAS o en sistemas de flujo.
Finalmente, Los juveniles de fletán del Atlántico (un gramo de peso corporal) se alimentaron con dietas con cinco niveles de PL que variaban del 9 al 32 por ciento de TL. No hubo efectos de los niveles de PL sobre el crecimiento o la composición de lípidos en el intestino, hígado y músculo, 24 horas después de la alimentación.
Sin embargo, tiempo después de la comida afectó la composición lipídica del tejido intestinal, con niveles más altos de lípidos neutros una y cuatro horas después de la prandial, y niveles más altos de lípidos polares, ésteres de colesterol y ceramida a las 24 horas posprandiales, reflejando la absorción de los lípidos poco después de la comida.
Parece que los juveniles de fletán negro regulan la composición de su especie de lípidos para que sean independientes de la dieta cuando se aplica una variedad de PL / Triacilglicerol, como en el presente estudio (ver figura 6).
Cría de larvas
Se desarrolló y describió un protocolo para el cultivo de nauplios de Artemia. El uso de Artemia en crecimiento durante el período crítico de metamorfosis en la larva de fletán del Atlántico no difirió del uso de nauplios de Artemia con respecto al crecimiento, Mortalidad y calidad de los alevines. Además, la producción de Artemia adulta fue laboriosa, y los altos costos de personal pueden ser prohibitivos en la implementación de esta fuente de alimento vivo en larvicultura comercial.
La producción comercial de alevines de fletán del Atlántico se lleva a cabo actualmente en sistemas de flujo continuo (FT), mientras que existe un consenso cada vez mayor de que un RAS ofrecería parámetros ambientales y químicos del agua más estables que conducirían a un mejor desempeño de las larvas.
Los protocolos de producción para el saco vitelino y la primera alimentación de larvas en RAS se desarrollaron en DIVERSIFY. No se detectaron diferencias en la supervivencia entre la cría de RAS y FT durante la incubación del saco vitelino. Cuando los sistemas se prepararon durante un mes, El crecimiento larvario fue significativamente mayor en el grupo RAS durante la primera alimentación. Se produjo una alta mortalidad en uno de los tanques FT.
Tomados en conjunto, Los resultados sugirieron que con un acondicionamiento adecuado del RAS, Se establece un sistema estable donde el crecimiento y la supervivencia de las larvas es tan bueno como, o mejor que en sistemas FT con óptimas condiciones. El RAS fue un sistema de cría más estable para las larvas de fletán del Atlántico en comparación con el sistema FT.
La caracterización metagenómica de las comunidades bacterianas en el agua de cría y las larvas reveló que al menos entre 300 y 400 géneros bacterianos diferentes estaban presentes en los sistemas de cría. Se detectaron diferencias significativas en la composición de la microbiota de los sistemas RAS y FT:tanto en silos como en tanques, y en el agua y las larvas.
No se observó una correlación obvia entre la microbiota en el agua y la microbiota de las larvas. La caracterización de la composición de la microbiota proporciona información importante para el desarrollo del tratamiento probiótico de las larvas de fletán negro.
Salud de los peces
Con el fin de desarrollar una vacuna contra la necrosis neural viral para las larvas de fletán atlántico, la proteína de la cápside de Nodavirus se expresó con éxito de forma recombinante en tres sistemas diferentes; E. coli, Leishmania tarentolae y en la planta del tabaco, y como se esperaba, hubo variación en la cantidad de expresión entre los sistemas.
Además, la proteína de la cápside recombinante expresada en Pichia fue proporcionada por el proyecto de la UE TARGETFISH. Estos cuatro sistemas de expresión difieren en la forma en que las proteínas expresadas se glicosilan postraduccionalmente. Al construir y usar E. coli y Leishmania tarentolea que expresan la proteína verde fluorescente (GFP), se pudo visualizar mediante microscopía de fluorescencia que Artemia se filtró de manera eficiente e ingirió estos microbios, y por tanto la proteína recombinante que alberga.
Artemia ingirió proteína de la cápside de Nodavirus recombinante expresada por los diversos sistemas, que podría confirmarse mediante inmunotransferencia.
La proteína de la cápside recombinante expresada por los diferentes sistemas se alimentó luego a Artemia, que se alimentaron a las larvas de fletán del Atlántico a 100 dph. Diez semanas después los juveniles en todos los grupos de tratamiento fueron desafiados por un i.p. inyección (ver figura 7) con Nodavirus para comprobar la eficacia.
Los peces desafiados se terminaron ocho semanas después del desafío y se analizaron para detectar la presencia de Nodavirus en el cerebro mediante RT-PCR en tiempo real dirigida al segmento viral RNA2. No se pudieron ver diferencias significativas entre los diferentes grupos de tratamiento, incluido el grupo con proteína recombinante que ha mostrado protección anteriormente.
Esto indica que el tamaño de los peces y la necesidad de clasificarlos para minimizar la gran variación entre individuos en diferentes fases en el momento de la vacunación tienen sus limitaciones inherentes y deben considerarse cuidadosamente.
En conclusión, aunque se ha demostrado que Artemia absorberá y acumulará las diversas formas de proteínas de la cápside de Nodavirus recombinantes y actuará como vector para la administración oral a las larvas de fletán negro, los experimentos de desafío indican que esta estrategia de suministro de antígeno no induce protección contra la infección por Nodavirus, al menos en las condiciones utilizadas en este estudio.
Se ha elaborado un manual de producción técnica para el fletán negro y se puede descargar del sitio web del proyecto en www.diversifyfish.eu.
Este proyecto de 5 años (2013-2018) ha recibido financiación del Séptimo Programa Marco de investigación de la Unión Europea, desarrollo tecnológico y demostración (KBBE-2013-07 monoetapa, GA 603121, DIVERSIFICAR).
El consorcio incluye 38 socios de 12 países europeos, incluidas nueve pymes, dos Grandes Empresas, cinco asociaciones profesionales y una ONG de consumidores, y fue coordinada por el Centro Helénico de Investigación Marina, Grecia.
