por Farshad Shishehchian, KritKhemayan, Zahra Javidi, Grupo de empresas Blue Aqua International, Tailandia
La acuicultura del camarón se ha visto dramáticamente afectada por muchas enfermedades patógenas, principalmente causada por V. parahaemolyticus y el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV). El objetivo de este estudio fue evaluar el uso potencial de dos aditivos alimentarios funcionales de AlphaGuard * L Plus (líquido) y AlphaGuard * P (polvo) compuestos de aceites esenciales (eucalipto, tomillo, orégano perteneciente a la familia Myrtaceae y Lamiaceae respectivamente), Triglicéridos de cadena media (MCT) y compuestos bioactivos naturales en camarones contra patógenos causados por enfermedades, especialmente V. parahaemolyticus y WSSV.
Los resultados indicaron que AlphaGuard * L Plus retrasó efectivamente el progreso de la enfermedad en camarones. Estos resultados sugieren que el aditivo alimentario funcional de AlphaGuard * P y AlphaGuard * LPLUS podría usarse para promover la defensa del camarón contra patógenos.
Introducción
La práctica de la intensificación de la acuicultura se ve obstaculizada por la salud y la nutrición que afectan el rendimiento del crecimiento. Para desenredar estas consecuencias, Se han utilizado aditivos alimentarios funcionales para estimular la inmunidad del camarón y mejorar el rendimiento del camarón, especialmente para controlar patógenos virales y bacterianos en el tratamiento reciente de enfermedades del camarón como V. parahaemolyticus que causó la enfermedad de necrosis hepatopancreática aguda (AHPND) y el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) que causó la mancha blanca Enfermedad (WSD), combinado con la implementación de medidas de bioseguridad.
La composición de AlphaGuard que compone MCT y aceite esencial está siendo reconocida como una práctica GRAS. En este estudio, la eficiencia del producto AlphaGuard se obtuvo mediante una combinación de los datos de los resultados de las pruebas de difusión por disco, desafíos e histología de la enfermedad, junto con una evaluación de los efectos del producto AlphaGuard sobre las enfermedades del camarón.
Materiales y métodos
Bacterias y virus patógenos
Dos patógenos virulentos en camarones, V. parahaemolyticus y V. harveyi en reserva de glicerol, se han subcultivado en caldo de soja tríptico (TSB) + uno por ciento de NaCl, incubados a 37oC durante 24 horas, antes se extendió sobre agar tiosulfato-citrato-sales biliares-sacarosa para obtener su cultivo puro.
Se preparó una suspensión de WSSV a partir del músculo de camarones infectados con WSSV. Brevemente, el WSSV que contenía el músculo de camarón se retiró del almacenamiento a -80 ° C y se cortó en trozos uniformes en condiciones estériles en frío y luego se homogeneizó en tampón TN (Tris-HCl 20 mM, 400 mMNaCl, pH 7,4) a 0,1 g / ml.
Después de centrifugar a 2, 000 rpm durante 10 minutos a 4 ° C, el sobrenadante se diluyó a 1:100 con 0,9 por ciento de NaCl y se filtró a través de 0,45 micrómetros. El sobrenadante resultante se almacenó a -80 ° C, hasta que se usó como fuente de inyección de WSSV para los experimentos de desafío.
La actividad antimicrobiana
Prueba de difusión en disco
5 µl de AlphaGuard * L Plus y AlphaGuard * P, concentración que va desde 0, 0,25, 0,5, Dilución al 1.0 y 10 por ciento con NaCl 0.85 por ciento, fueron absorbidos en cinco milímetros de diámetro, Los discos de papel de 0,9 mm de espesor se secaron al aire antes de colocarlos en 105 células de cultivo de bacterias en una placa de Petri de 100 x 15 mm de ancho. Se utilizó una solución de NaCl al 0,85 por ciento como control negativo. Se utilizaron tres placas replicadas para cada tratamiento y las observaciones se registraron después de 24 horas.
Infección artificial por V. parahaemolyticus y determinación del número de Vibrio en la hemolinfa (HL) y el hepatopáncreas (HP) del camarón
V. parahaemolyticus se reactivó a partir del almacenamiento a -80 ° C y se cultivó en TSB + NaCl al uno por ciento a 37 ° C durante la noche. El cultivo se centrifugó a 5ºC. 000 rpm durante 10 minutos, para eliminar el sobrenadante, y el sedimento se resuspendió en NaCl al 0,85 por ciento estéril hasta una densidad de 8,4 x 106 UFC / ml.
El camarón, en la quinta semana, se infectaron inyectando 100 μL de la suspensión bacteriana en el segundo segmento abdominal de camarones sanos en la quinta semana de cultivo y se registró la mortalidad durante siete días.
Los camarones se recolectaron al azar el tercer día después de la infección para cada tratamiento y se lavaron tres veces con agua esterilizada. Se extrajo HL de la cavidad pericárdica usando una jeringa desechable estéril de un ml en condiciones estériles y se agregó a un volumen igual de anticoagulante estéril (agregando EDTA-Na2 10 mM a 450 mMNaCl, 10 mMKCl, HEPES 10 mM, pH 7,3, 850 mOsm.kg-1 o Tris-HCl 10 mM, Sacarosa 250 mM, Citrato de sodio 100 mM, pH 7,6).
El HL y el HP molido se diluyeron en serie 10 veces con PBS estéril frío. Cada dilución se extendió en placas de agar TCBS colocadas boca abajo en una incubadora a 37 ° C y se cultivó durante 16-20 horas. Se contaron las placas que contenían de 30 a 300 colonias bacterianas, luego, los números se registraron como UFC / ml o UFC / g.
Infección artificial por WSSV
Se inyectaron por vía intramuscular ml del filtrado en camarones sanos en la quinta semana de cultivo. Los camarones se recolectaron al azar seis horas después de la infección para un examen histopatológico y se registró la mortalidad f durante siete días.
Condiciones de crecimiento del camarón y grupos experimentales
Los camarones se compraron en granjas tailandesas locales. Fueron negativos para V. AHNPD y WSSV causados por parahaemolyticus mediante análisis de PCR. Después de aclimatarse durante una semana en un acuario, antes del experimento, camarones aparentemente sanos con una longitud corporal uniforme se dividieron al azar en tres grupos con seis repeticiones por grupo, 20 camarones por réplica.
La capacidad del acuario era de 100 litros, que contiene 60 litros de agua de mar. La propiedad del agua salina se mantuvo en 15 ppt, pH 7.7-8.0 y DO> 4.0 mg / L. Cada tratamiento contiene camarones juveniles con un peso inicial promedio de 2.6 g sembrados al azar en cada tanque.
Los camarones fueron alimentados hasta la saciedad hasta alrededor del 2.5-3 por ciento de su peso corporal, tres veces al día durante cinco semanas. La alimentación se ajustó diariamente, según su tasa de ingesta, para asegurarse de que el alimento se consumiera por completo. Antes de alimentar, mudas, heces, y se sacaron camarones muertos, El 20 por ciento del agua de cada tanque se cambiaba cada tres días por agua de mar nueva.
Dietas experimentales y recopilación de datos
Todos los grupos se mantuvieron, durante el experimento, en las mismas condiciones que la aclimatación. El grupo de control fue alimentado con gránulos comerciales de camarón, recubierto con un uno por ciento de quitina-quitosano. Los grupos de tratamiento fueron alimentados con AlphaGuard * L Plus rociado o AlphaGuard * P, mezclado con gránulos comerciales de camarón y recubierto con un uno por ciento de quitina-quitosano, a dosis de 5,0 ml o g / kg de pienso. Los parámetros de mortalidad y calidad del agua se registraron diariamente. Al final del juicio, se evaluó la tasa de supervivencia.
análisis estadístico
Unidades experimentales de análisis estadístico, tanques y los acuarios se distribuyeron de forma completamente aleatoria. Se verificó la normalidad y homocedasticidad de los datos cuantitativos. Los datos se analizaron mediante el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para buscar diferencias significativas (p <0,05) entre las medias de tratamiento.
Resultados
La actividad antibacteriana por métodos de difusión por disco e inclusión en la dieta del camarón sobre la resistencia a enfermedades de AlphaGuard * L Plus o AlphaGuard * P
Prueba de difusión en disco
Las concentraciones de AlphaGuard * L Plus y AlphaGuard * P inhiben al menos un uno por ciento tanto a V. harveyi como a V. parahaemolyticus, sin embargo, hubo mayor eficacia de inhibición para V. parahaemolyticus en comparación con V. harveyi. La concentración efectiva de AlphaGuard podría haber disminuido si hubiéramos diluido en lípidos solubles, como el etanol, para las pruebas.
Composiciones de aceites esenciales, Las técnicas de ensayo y el modo de acción han sido revisados intensamente. Este estudio no investigó en detalle molecular sus mecanismos, sin embargo, el principal efecto de las propiedades bactericidas podría estar relacionado con su interferencia de la integridad de la membrana y la permeabilidad como el compuesto lipofílico del aceite esencial y los MCT.
Los diferentes ácidos grasos en los MCT tienen una concentración mínima inhibitoria (MIC) diferente, dependiendo del tipo de ácido graso, microorganismo, y pH ambiental. El aspecto sinérgico y antagónico entre los ingredientes de AlphaGuard no se aclara en este estudio. El aceite esencial en AlphaGuard también actúa como un antioxidante para prevenir o ralentizar la oxidación de MCT insaturados para prolongar su vida útil además de anti-estrés en camarones.
Prueba de provocación de V. parahaemolyticus
Al final del experimento de prueba de piensos, los camarones fueron desafiados por V. parahaemolyticus. Se trazó la tasa de mortalidad acumulada (ver figura dos). Los resultados de la tasa de mortalidad, después de la exposición a V. parahaemolyticus durante un intervalo de siete días, mostró que los grupos de camarones alimentados con AlphaGuard * P y AlphaGuard * L Plus tenían tasas de mortalidad significativamente más bajas que en comparación con el grupo de control después del día cuatro de la infección.
Tanto AlphaGuard * P como AlphaGuard * L Plus tuvieron la misma tasa de mortalidad estadística después del día cinco de la infección. Al final del experimento, a diferencia de, la tasa de supervivencia no se correlacionó estadísticamente con la tasa de mortalidad para AlphaGuard * P, (ver figura tres).
La capacidad de eliminación de camarones de Vibrio spp. después de tres días de infección se trazó, (ver figura cuatro). Los resultados indicaron que Vibriospp. el recuento en la hemolinfa de camarones alimentados con AlphaGuard * P y AlphaGuard * LPlus fue menor que en los grupos controlados. La capacidad de los camarones para defenderse de las bacterias en HP, alimentado por AlphaGuard * LPlus, también tenía una capacidad de defensa mucho mejor que los camarones no alimentados con AlphaGuard.
Prueba de desafío WSSV
La prueba de provocación de WSSV se realizó después de cinco semanas de la prueba de alimentación. Se representó gráficamente la mortalidad acumulada, (ver figura cinco). El grupo de camarones alimentados con AlphaGuard * L Plus mostró un retraso significativo en la mortalidad, en comparación con los grupos de control y AlphaGuard * P-crimp durante su segundo, tercer y cuarto día, (ver figura seis).
Esto coincide con ningún signo histopatológico de tinción con H&E del tejido infectado por WSSV en el área de inyección. excepto la generalización de la necrosis muscular que probablemente esté relacionada con el mecanismo de defensa del camarón después de tres días de infección. Sin embargo, todos los grupos terminaron con una mortalidad del 100 por ciento.
Conclusión
Los resultados de este ensayo sugirieron que la aplicación del aditivo alimentario AlphaGuard * P y AlphaGuard * L Plus al 0.5 por ciento con alimento comercial demostró la eficacia para promover la defensa del camarón contra patógenos. AlphaGuard * L Plus mostró especialmente un mejor rendimiento.
